细胞培养离开这几个条件，成功率极低

　　细胞培养的条件一般离不开这5个：合适的细胞培养基、优质血清、无菌无毒细胞培养环境、恒定的细胞生长温度、合适的气体环境

　　绝大部分细胞消化的时候是只要用胰酶润洗一遍即可。吸去胰酶后，残留的那些无法计算体积的附着在细胞表面的微量胰酶在37℃一般不到2min足够消化细胞（绝大部分1min不到）。对于这些细胞原则上不要用胰酶孵育细胞，连续这样传代，对细胞伤害很大。

　　不是细胞全部成间隔分布很离散的单个圆形才算消化好了，一般你肉眼观察贴壁细胞层，只要能移动了，多半呈沙壮移动，其实已经可以了，很多人喜欢把细胞消化或者吹打成*分离细胞，这是没有必要的。一般能移动了，说明细胞与培养基质材料的附着已经消失了，细胞之间的附着也已经消失了，细胞已经独立分布了（虽然没有呈现很广的离散分布）。这个时候应该停止消化，不要等到看到镜下所有细胞都分离得非常好，间隙很大，才停止。

　　细胞就是*成单个细胞悬液，之后在贴壁的过程中仍然会聚集，这个是贴壁培养的细胞，尤其是肿瘤细胞的一个特性，无论死活的细胞都是如此，你可以尝试，准备100%的单个细胞悬液，贴壁后观察细胞，仍然是几个几个细胞聚集在一起。一些悬浮培养细胞也是如此，容易聚集，不要去尝试过几个小时就拿出来吹打成单细胞悬液（不要笑，这个是初养悬浮细胞的人常犯的错误，以为悬浮培养就是一个一个分开）。细胞只要能从基质上脱离下来，这个时候即使是成片的（比如Calu-3细胞），吹打不超过20次后（一般10次即可），成小规模聚集（10个细胞左右），是正常的，不要试图再去延长消化时间，或者象有的同学那样吹打1h，等待单细胞悬液出现。

　　比较难消化的细胞（润洗方法5min还不能消化），就以coloncancer为例，比如HCT15,LS411和KM12，这样的细胞一般需要用少量胰酶孵育，但也不需要很多，一般100mmdish，一次多加入500ul，就足够了，一般我加300ul。即使这样难消化的细胞，一般不超过5min，即可见细胞成片移动，就应该停止消化。一些正常细胞也会有难消化的时候，比如tsDC细胞，但也只要用少量胰酶孵育，3min左右即可看到成片沙状移动。