细胞培养知识（二）

无菌操作基本技术
1. 实验进行前，无菌室及无菌操作台（laminar flow） 以紫外灯照射30-60 分钟灭菌，以70% ethanol 擦拭无菌操作抬面，并开启无菌操作台风扇运转10 分钟后，才开始实验操作。每次操作只处理一株细胞株，且即使培养基相同亦不共享培养基，以避免失误混淆或细胞间污染。实验完毕后，将实验物品带出工作台，以70% ethanol 擦拭无菌操作抬面。操作间隔应让无菌操作台运转10 分钟以上后，再进行下一个细胞株之操作。
2. 无菌操作工作区域应保持清洁及宽敞，必要物品，例如试管架、吸管吸取器或吸管盒等可以暂时放置，其它实验用品用完即应移出，以利于气流之流通。实验用品以70% ethanol 擦拭后才带入无菌操作台内。实验操作应在抬面之中央无菌区域，勿在边缘之非无菌区域操作。
3. 小心取用无菌之实验物品，避免造成污染。勿碰触吸管尖头部或是容器瓶口，亦不要在打开之容器正上方操作实验。容器打开后，以手夹住瓶盖并握住瓶身，倾斜约45°角取用，尽量勿将瓶盖盖口朝上放置桌面。
4. 工作人员应注意自身之安全，须穿戴实验衣及手套后才进行实验。对于来自人类或是病毒感染之细胞株应特别小心操作，并选择适当等级之无菌操作台（至少Class II）。操作过程中，应避免引起aerosol 之产生，小心毒性药品，例如DMSO 及TPA 等，并避免尖锐针头之伤害等。
5. 定期检测下列项目： 5.1. CO2 钢瓶之CO2 压力 5.2. CO2 培养箱之CO2 浓度、温度、及水盘是否有污染（水盘的水用无菌水，每周更换）。 5.3. 无菌操作台内之airflow 压力，定期更换紫外线灯管及HEPA 过滤膜，预滤网（300小时/预滤网，3000 小时/HEPA）。
6. 水槽可添加消毒剂（Zephrin 1:750），定期更换水槽的水。

实验用品
1. 种类?
  1.1. 细胞培养实验用品均为无菌，除了玻璃容器与pasteur pipet 外，其它均为塑料无菌制品。
  1.2. TC 级培养盘表面均有coating 高分子物质以让细胞吸附，培养容器种类有Tflask,plates, dishes, roller bottle 等，依实验需要使用。
  1.3. plastic sterile pipet: 1ml, 2ml,5ml, 10ml, 25ml
  1.4. 塑料离心管: 15ml, 50ml，均有2 种不同材质，其中polypropylene （PP） 为不透明材质，polystyrene （PS） 为透明材质，可依实验需要而选择适合材质之离心管。
  1.5. glass pastuer pipet: 9 inch，用以抽掉废弃培养液等。
  1.6. 玻璃血清瓶（Pyrex or Duran glassware）：100ml, 250ml,500ml,1000ml
2. 清洗? 2.1. 新购玻璃血清瓶先以0.1~0.05 N HCl 浸泡数小时，洗净后才开始使用。 2.2. 用过之玻璃血清瓶，以高压蒸汽灭菌，洗净后分别用一次与二次去离子水冲洗干净，勿加清洁剂清洗。
3. 灭菌?
  3.1. 实验用玻璃血清瓶以铝箔纸包覆瓶盖，高压蒸汽灭菌121℃, 15 lb, 20 分钟，置于oven 中烘干。
  3.2. 实验用玻璃pasteur pipet 以干热灭菌170℃, 4 小时。  
  3.3. 液体或是固体废弃物可用10% hypochloride 溶液（次氯酸，即漂白水） 或是蒸汽高压灭菌121℃, 15 lb, 20 分钟处理。

培养基
1. 液体培养基贮存于4℃冰箱，避免光照，实验进行前放在37℃水槽中温热。
2. 液体培养基（加血清） 存放期为六个月，期间glutamine 可能会分解，若细胞生长不佳，可以再添加适量glutamine。
3. 粉末培养基配制（以1 升为例）：
  3.1. 细胞培养基通常须添加10% 血清，因此粉末培养基之配制体积为900ml，pH 为7.2 - 7.4。NaHCO3 为另外添加，若将NaHCO3 粉末直接加入液体培养基中会造成pH 之误差，或局部过碱。因此粉末培养基及NaHCO3 粉末应分别溶解后才混合，然后用CO2 气体调整pH，而非用强酸（HCl）或强碱（NaOH），因为氯离子对细胞生长可能有影响，且贮存时培养基的pH 易发生改变。   3.2. 材料：
   3.2.1. 纯水（milli-Q 水或二次至三次蒸馏水，水品质非常重要）
   3.2.2. 粉末培养基
   3.2.3. NaHCO3 （Sigma S-4019）
   3.2.4. 电磁搅拌器
   3.2.5. 无菌血清瓶
   3.2.6. 0.1 或0.2 mm无菌过滤膜
   3.2.7. pH meter
   3.2.8. 真空帮浦
   3.2.9. CO2 气体
  3.3. 步骤：
   3.3.1. 取粉末培养基溶于700ml milli-Q 水中，搅拌使其溶解。
   3.3.2. 称取适量之NaHCO3 粉末（数量依培养基种类而异，表一）溶于200ml milli-Q 水中，搅拌使其溶解，然后通入CO2 气体至饱和，约3-5 分钟。
   3.3.3. 将溶解且含饱和CO2 之NaHCO3 溶液加入溶解之液体培养基中混合。混后溶液之pH应为7.2-7.4，除非pH 值偏差太大，否则不需用酸碱再调整之。若为太碱，可再通入CO2 气体调整pH。培养基以真空帮浦通过过滤膜时，pH 会升高0.1-0.2。
   3.3.4. 以0.1 或0.2 mm 无菌过滤膜过滤灭菌，同时分装至无菌容器中，标示培养基种类、日期、瓶号等，贮存于4℃。（血清亦可加入培养基中一起过滤）
   3.3.5. 配制之培养基配制须作生长试验与污染测试。
4. 配制培养基之生长测试
4.1. 材料：
4.1.1. MDCK cell （ATCC CCL-34 或CCRC 60004） 4.1.2. 6-well TC plate （or 35 mm TC dish）
4.1.3. methanol
4.1.4. glacial acetic acid
4.1.5. 10% Giemsa solution （GibcoBRL 10092-013）
4.2. 步骤：
4.2.1. 以待测试培养基培养MDCK cell，接种MDCK 细胞于6-well plate （或35mm TC dish） 中，每个well 接种1 × 102 活细胞，同时作对照组实验。
4.2.2. 接种5～7 天后，在100 倍倒立显微镜作观察细胞群落之生长，待细胞群落大到可以肉眼观察，而群落间不互相接触时即可。 4.2.3. 去除培养基，加入1ml Carnoy’s 固定液（甲醇：冰醋酸? 3:1），室温下静置10 min。
4.2.4. 去除固定液，水洗二次。
4.2.5. 加入1ml 10% Giemsa solution，，室温下静置染色2-3 min。
4.2.6. 去除染液，水洗二次。
4.2.7. 以肉眼计数群落数，并比较之，若新配制或新批号的培养基对细胞生长不佳，则丢弃之。