细胞培养的常见污染原因及其预防

　　如何保持无菌，是每个细胞培养实验室一直面对的难题。污染几率增加的主要原因包括：操作技术不严格，试剂质量不达标，大气中孢子计数增加，培养箱或操作台使用和维护不当，污染了的冰箱和水浴锅。因此，在细胞培养过程中，操作者不仅要严格遵守标准的操作程序，同时还要特别注意新产品、新品牌、以及设备的清洁维护。

　　细胞作为重要的实验模型广泛应用于各类生物实验,几乎所有科研实验室中都需进行细胞培养。细胞培养过程中最大的威胁就是细胞污染,凡是混入细胞培养环境中,对细胞生存有害的成分和造成细胞不纯的异物都应视为污染。细胞一旦遭到污染,所有的实验结果都会变得毫无意义。因此,及时检测并鉴定出所培养的细胞是否被污染至关重要。

　　污染来源

　　细胞培养实验室要求保持无菌操作，避免微生物及其他有害因素的影响。细胞培养室要相对封闭，洁净无尘，设有缓冲间。对实验室进行定期清扫、紫外消毒是避免细胞培养过程中由于实验室环境引起细胞污染的主要措施，此外，实验室内不要放太多杂物，保持实验室干燥，有利于降低因实验室条件引起的细胞污染率。

　　细胞培养过程中实验人员是否操作规范，是否严格遵守无菌工作流程，是细胞污染的一个主要因素。操作人员进培养室前，必须先洗手，在缓冲间换穿专用实验服和拖鞋，严禁在实验进行时频繁出入培养室。实验后应将实验产生的废物和废液及时清理出培养室，并清洁无菌工作台。

　　常见污染原因

　　1、细菌、真菌污染

　　细菌和真菌污染很容易被检测,因为受到细菌、真菌污染的细胞,培养过程中培养基会出现肉眼可见的明显特征。细菌污染会导致培养基出现浑浊、颜色改变以及pH值急剧变化,受污染的贴壁细胞在几天内会逐渐脱壁死亡。真菌污染后的细胞生长速度变慢,培养基中会漂浮白色、浅黄色或黑色的小点。因此,通过观察培养基的颜色、漂浮物、pH值或在显微镜下观察细胞及其生长状态,从而能初步判断该细胞是否受细菌、真菌污染。也可以使用培养检测法：将细胞培养物在各类培养基中适温培养若干天后,观察是否有细菌或真菌生长。

　　2、支原体污染

　　支原体污染会影响细胞的形态、功能、代谢、细胞膜、生长速率、诱导染色体畸变、细胞内信号传导等各种细胞特性。受支原体污染的细胞在培养时培养基的pH值不会发生改变,也不会浑浊,因此,很难直接观察出细胞是否受到污染。

　　常用的支原体检测DNA荧光染色法：使用荧光染料DAPI或Hoechst33258染色，荧光染料能选择性的结合细胞和支原体DNA的小沟,因此,在准备过程中,任何存在的DNA均会被染色。被支原体污染的细胞经染色后,细胞核外与细胞周围可看到许多大小均一的荧光点。

　　3、霉菌污染

　　霉菌污染早期，应用PBS多次冲洗细胞，尽量将孢子洗掉，然后用两性霉素处理。两性霉素对细胞生长影响也很大，浓度过高可致细胞死亡，浓度过低时则不能抑制霉菌生长。

　　4、病毒污染

　　有关病毒污染的资料不多，但一般认为病毒污染不影响细胞培养，通过PCR技术可以检测。不过病毒污染对生产疫苗是不安全的。因此，至今，潜在病毒是细胞大量生产和疫苗、干扰素等生物制品制作的难题。有研究显示用伽马射线可清除牛血清的大部分病毒，现如今值得期待的是下游工艺中除病毒过滤器的开发。

　　结合文献报道和本人的实际经验认为，在细胞培养过程中，潜在的污染途径主要包括操作技术和环境，其中环境因素又包括了无菌试剂和材料、超净工作台、恒温恒湿培养箱、水浴锅和冰箱等。

　　一、操作技术

　　培养操作前——

　　⑴个人卫生：进入细胞培养室时应更换实验室专用鞋或者穿鞋套；穿戴实验服、口罩和手套，用消毒酒精（75%浓度的乙醇）擦拭双手；如果操作者是长发，应扎于脑后。

　　⑵工作台准备：提前0.5~1h打开超净台的紫外灯进行消毒；用蘸有消毒酒精的纸巾擦拭超净台的台面、挡板等。

　　⑶试剂准备：从冷藏室或冷冻室取出所需的培养基等试剂，于37℃水浴锅中进行加热；加热后用消毒酒精擦拭瓶身，并立马放入超净工作台内。

　　须注意的事项有：外套、书包等物品，易附着丰富的微生物，不应带入细胞房。

　　培养操作中——

　　⑴台面布置：按实验需要和个人习惯，合理放置试剂、耗材、仪器等物品；点燃酒精灯后开始实验操作。

　　⑵操作：靠近火焰进行实验操作；试剂瓶经火焰旋转灼烧后打开；挑选吸管，快速的纵向在火焰上来回移动并做180°旋转；将试剂瓶向吸管倾斜，吸出所需的液体量；灼烧瓶颈后，重新盖上盖子；等所有操作完毕后，拧紧瓶盖。

　　须注意的事项有：操作要准确、敏捷、有序；吸取溶液时，应专管专用，避免交叉污染；吸管管口要向下倾斜，以防止液体倒流进入移液器内发生污染；尽量减少细胞和培养基的敞口时间；已开口的试剂瓶尽可能的倾斜放置，防止下落微生物的污染；避免在敞口的细胞培养皿及培养皿盖上方操作；不要面对工作台或细胞培养箱讲话或咳嗽，防止口腔微生物随唾沫飞入而发生污染；若发生外溢，用蘸有消毒酒精的棉球及时擦去。

　　培养操作后

　　⑴整理：将试剂放回原来的存储位置；整理工作台面，物归原位，合理丢弃废液和废物。

　　⑵消毒：用消毒酒精擦拭台面；打开超净工作台和细胞房的紫外灯，照射至少15min。

　　须注意的事项有：紫外灯开启后，人不能进入，紫外线对眼睛和裸露的皮肤均有危害，若要进入，一定要先关闭紫外灯，待人离开后打开。

　　二、环境

　　如果操作者技术规范且操作严谨，那么当环境恶化时，也会导致污染风险的增加。进行细胞培养时，环境必须洁净。

　　恒温恒湿培养箱——细胞污染一个主要的途径就是恒温恒湿培养箱。恒温恒湿培养箱，在培养细胞取出和放入的过程中，直接与空气接触，微生物会被夹带进入；加之其内部湿度高、温度适宜，特别有利于真菌繁殖。细胞培养瓶或培养皿，如果接触了操作台以外的地方，在放入培养箱前须经消毒酒精擦拭。但须注意的是，消毒酒精要经操作台吹干，否则会导致培养箱内乙醇浓度升高，酒精会影响细胞的正常功能。

　　在很多情况下，细胞培养必须使用恒温恒湿培养箱。为了有效的控制该污染途径，可采取的措施有：①在加湿托盘内添加真菌抑制剂，如硫酸铜、十二烷基磺酸钠，可抑制托盘内真菌的生长；亦或盛装无菌的去离子水，并每周进行更换，托盘用消毒酒精或高温灭菌的方法进行严格的清洁；②使用无毒抗真菌清洁剂对培养箱内外进行定期清洁，先用清洁剂、再用消毒酒精进行擦拭；为不留死角，清洁前应将培养箱内部能拆卸的部件都拆卸下来，清洁时也特别要注意不能拆卸的犄角旮旯处；③不正确的使用空气过滤器，那将变为培养箱一个可怕的污染途径，故须按使用说明定期更换空气过滤器；④在使用过程中，任何溢出液必须立刻用消毒酒精清除干净；⑤一旦发现培养物被污染，立马清走。