用细胞刮刀实验时

　　实验步骤：无菌条件下取新生小牛大脑皮层灰质部，4℃D-Hank′s液洗涤4次，至无血迹残留。剪成1mm3左右的组织碎块并置于玻璃匀浆器内，加入两倍体积的MEM培养基，匀浆上下20次？匀浆液先用100目（直径149μm）尼龙网布式漏斗抽滤，培养基洗涤4次，收集滤液。然后用200目（直径74μm）尼龙网布式漏斗抽滤，MEM培养基洗涤4次。细胞刮刀收集200目尼龙网上的组织（即牛脑微血管），将其置于离心管中，1500r/min离心洗涤10min。离心洗涤的脑微血管悬浮于的0.1%胶原酶中，旋涡振荡15sec以充分混匀，置于37℃恒温振荡水浴箱中振荡消化50min？取出后旋涡振荡15sec，1500r/min离心10min，弃上清，用20%BCS的培养基悬浮，接种于明胶铺被的培养瓶中（培养瓶中加入1%明胶-D-Hank′s液洗涤3ml，37℃孵箱中放置24h，用前倒掉明胶溶液即得明胶覆盖的培养瓶），置于细胞培养箱中，37℃、5%CO2、饱和湿度条件下培养。静置5～7天后，可见少量细胞生长，20%BCS的MEM培养液换液，以后每2～3天换液一次，至细胞长成致密单层后可传代培养。

　　1、提前准备好Matrigel（BD 354277）包被过的六孔板，吸弃孔内包被液，加入2ml BeYaMATM 1*培养液。

　　2、吸弃待传代hESCs/hiPSCs孔内的培养液，并用1ml无钙镁的PBS洗1遍。

　　3、加入0.5ml Accutase细胞分离液使之*覆盖皿底。

　　4、室温孵育5-8分钟或37℃孵育3-5分钟，显微镜下观察到大部分克隆细胞间出现间隙，细胞表面发亮但尚未相互分离时，可吸去Accutase。

　　5、可将培养板放置37℃继续孵育1min,或者直接加入适量新鲜BeYaMATM 1*培养液，轻轻摇晃，干细胞集落基本脱落。亦可用细胞刮刀将剩余克隆轻轻刮下，尽量避免用枪头反复吹打细胞。

　　6、将制备好的细胞悬液按1：3-1：6的比例接种至准备好的培养板中，注意细胞过密则克隆边界不圆滑，易分化，细胞过稀则克隆存活率降低。

　　7、轻轻摇晃培养板让细胞均匀分散，置于37℃，5%CO2培养箱中培养8小时。

　　8、每天更换培养液，待细胞密度达到80%以上，或者克隆中央密度过大，影响细胞生长时进行传代。